Role of ADAM-17, p38 MAPK, Cathepsins, and the Proteasome Pathway in the Synthesis and Shedding of Fractalkine/CX3CL1 in Rheumatoid Arthritis

Jones BA1, Riegsecker S, Rahman A, Beamer M, Aboualaiwi W, Khuder SA, Ahmed S.

Arthritis Rheum. 2013 Nov;65(11):2814-25

＜Methods and Results＞
Time dependent synthesis and sheding of FKN in RASFs
Fig1.
A,C cellular FKN : 24時間以降は減少→膜結合型から可溶性となり上清中に出たから？
B,D soluble FKN：24時間以降で上昇してくる。
E immunostaining：6時間でcellulerのFKNが上昇し24時間でpeakとなる。
→TNF/IFNの刺激が入ることで細胞内と上清中にFKNが高発現する

Involvement of ADAM-17,but not ADAM-10 or caspase 3 ,in TNF-α/INF-γ-induced FKN shedding
Fig2.
ADAM-17はFKNのsheddingに関与しているがADAM-10はそれを調節する役割があるとの報告。
A 翻訳のlevelではADAM-17は上昇するがADAM-10は上昇しない。
B 転写のlevelではADAM-17、ADAM-10ともに上昇する。
C ADAM-17/MMPsのinhibitor(GM6001)を用いるとFKN、sFKNの産生が低下する。(部分的であり他のpathwayがsFKNの産生に関与している可能性あり。)
D 関節破壊に関与するほかのMMP2に関して、MMP2のinhibitor(MG132)を用いるとMMP2:が抑制されるが、GM6001を用いてもMMP2は抑制されない。
E Human MMP array kit ：GM6001を用いるとMMP-1、MMP-3、TIMPを控えめに抑制する。
DE→他のMMPsはsFKNの産生には関与しない→GM6001はADAM-17を選択的に抑制する。
F ADAM-17、ADAM-10の siRNAを用いると両方knock downされる。
G ADAM-17　siRNAを用いてTNF/IFNで刺激した際のsFKNの産生について、contorol siRNAと比較してADAM-17 siRNAを用いたものに関してはsFKNの産生が低下した。
→ADAM-17はFKNのsheddingに関わる。

Essential role of p38 MAPK, Cathepsins, and proteasome pathway in mediating TNF-α/INF-γ-induced sFKN production in RASFs
Fig3
A chemical inhibitor を用いて細胞内シグナルを評価。使用したchemical inhibitorは以下の通り。
PKC(Ro-31),proteasome activity(MG132),p38 MAPK(SB),JNK/SAPK(SP),ERK(PD),STAT-3(AG)
① MG132を用いるとsFKNの産生が完全に抑制される。
② P38 MAPK　も44%抑制する。
→シグナル伝達にはproteasome、p38 MAPKが関与している。
B proteasomeの他にCathepsin(Cathepsin I)とCalpain(Calpeptin)に関してinhibitorを用いてsFKNの産生を評価→Cathepsinのinhibitorを用いるとsFKNの産生が抑制される。
C 蛋白合成阻害薬(cycloheximide)、mRNA合成阻害薬(actinomycin D)を用いるとsFKNの産生が抑制された。

Effect of TNF-α/INF-γ in inducing activation of the p38 MAPK pathway in RASFs
Fig4.
A TNF-α/IFN-γで刺激後1分からp-P38 MAPKが上昇する。→sFKNの合成の主要なシグナル経路である。
B IκBαは刺激後すぐにリン酸化が起こり、15分ほどで消失する。→NFκBの核内転座と活性化はIκBαのプロテアソームによる分解を経由していることが示唆される。

Coordination of TNF-α and IFN-γ to induce 20S proteasome activity in RASFs(A)
Synergism of TNF-α-induced activation of NFκB/p65 in RASFs by IFN-γ(B,C)
Fig5.
A TNF-α/IFN-γで刺激した際に20S proteasome 活性は上昇する。
B TNFの刺激により核内にNFκB p65(転写因子)が高発現。
C DNA biding ELISA：NFκB p65が刺激による上昇

Correlation of increased FKN expression and increased ADAM-17, ADAM-10, and phosphor-p38 MAPK expression in the ankles of rats with AIA
Fig6.
メスのマウスに凍結保存されたMycobacterium butyricumを皮下注射(Day0),Day17で足関節の周囲径を計測
A naïveと比較して周囲径は大きい　B FKNの濃度も高い。
C 関節をホモジネートしたものにおいて、AIAの方がADAM-17、ADAM-10、p-p38MAPKが高発現していた

＜Conclusion＞
今回 ADAM-17、p38MAPK、cathepsin、proteasome pathwayがFKNの上昇に関与しており、それを抑制することでFKNにともなう炎症や細胞障害を抑制することができる可能性がある。

担当：古屋秀和