Vascular endothelial growth factor signaling in VE-cadherin expression and tube-like formation by rheumatoid arthritic synovial fibroblast-like cells.

Yamaguchi K¹, Sudo H¹, Imai K².

1. Department of Biochemistry, The Nippon Dental University School of Life Dentistry at Tokyo, 1-9-20 Fujimi, Chiyoda-ku, Tokyo, 102-8159, Japan.
2. Department of Biochemistry, The Nippon Dental University School of Life Dentistry at Tokyo, 1-9-20 Fujimi, Chiyoda-ku, Tokyo, 102-8159, Japan. Electronic address: kimai@tky.ndu.ac.jp.

Biochem Biophys Res Commun. 2019 Jan 8;508(2):405-409.

【目的】
関節リウマチ患者の滑膜線維芽細胞におけるVEGFとVE-cadherinの関連、シグナル伝達経路とtube-like formationを調べる。

【Methods and Results】

Figure 1
RSFLsからVE-CDHが発現しているのかを確認した
1-A/B：RSFLsを0-160ng/mlの範囲で濃度を変えたVEGFで刺激しVE-CDHの発現を見た。
→80ng/mlと160ng/mlおよび刺激48時間後と72時間後で有意差をもってVE-CDHの発現を認めた。
1-C：RSFLsをVEGFR2 antagonistであるVEGF mimicking peptideで刺激しVE-CDHの発現を見た。
→濃度依存性にVE-CDHの発現は有意差をもって低下した。
1-D/E：RSFLsをVEGFR2 inhibitorであるSU1498とPTK787で刺激しVE-CDHの発現を見た。
→濃度依存性にVE-CDHの発現は有意差をもって低下した。
1-F：RSFLsをsiVEGFR2であるs7822およびs7824で刺激しVE-CDHの発現を見た。
→濃度依存性にVE-CDHの発現は有意差をもって低下した。
1-G：VE-CDHのmRNAレベルでの発現を確認するために、RSFLsに図に示された物質で刺激しVE-CDHのmRNAの発現を見た。
→それぞれ有意差をもって低下した。

Figure 2
VEGFとVEGFR2によってERKとAKTの経路が活性化させるかを調べた
2-A：RSFLsを0-160ng/mlの範囲で濃度を変えたVEGFで15分刺激し、ERKとAKTのリン酸化をWestern blotting法で確認した。
→ERK/pERK、AKT/pAKTは80ng/mlと160ng/mlで有意差をもって発現が亢進した。
2-B：RSFLsを2.5-40ng/mlの範囲で濃度を変えたVEGFR2 antagonistであるVEGF mimicking peptideで刺激しERKとAKTのリン酸化をWestern blotting法で確認した。
→VEGF mimicking peptideで刺激するとリン酸化は抑制された。
2-C：RSFLsをVEGFR2 inhibitorであるSU1498またはPTK787で刺激し、ERKのリン酸化をWestern blotting法で確認した。
→SU1498またはPTK787の濃度が上昇するにつれ、ERKのリン酸化は抑制された。
2-D：RSFLsをVEGFR2 inhibitorであるSU1498またはPTK787で刺激し、AKTのリン酸化をWestern blotting法で確認した。
→SU1498またはPTK787の濃度が上昇するにつれ、AKTのリン酸化は抑制された。

Figure 3
3-A：RSFLsをERKの上流のMEKを阻害するPD98059(左)、AKTの上流のPIK3を阻害するLY294002(中)、AKTの下流のmTORを阻害するRapamycn(右)でそれぞれ8時間刺激し、ERK、AKT、TORのリン酸化をWestern blotting法で確認した。
→それぞれの濃度が上昇するにつれ、リン酸化は抑制された。
3-B：RSFLsをPD98059(左)、LY294002(中)、Rapamycn(右)でそれぞれ72時間刺激し、VE-CDHの発現をWestern blotting法で確認した。
→それぞれの濃度が上昇するにつれ、VE-CDHの発現は抑制された。
3-C：3-Bの内容をreal-time PCRを用いて、VE-CDHをmRNAレベルで確認した。
→それぞれ、VE-CDHのmRNAの発現は抑制された。

Figure 4
VEGF、VE-CDHの血管新生への関与を調べるために、RSFLsに80ng/mlのVEGFと4-Bに示すような阻害剤を加えmatrigel assayを施行した。
→阻害剤を加えたものはtube形成が抑制された。

 

・今後の研究展開や論文に対する検討課題
VE-CDH、VEGFとADAM-15との関連

・自分なりの疑問点
VE-CDHとその他のサイトカインとの関連

 

担当：西見慎一郎