Angiogenic and Arthritogenic Properties of the Soluble Form of CD13

J Immunol. 2019 Jul 15;203(2):360-369

Abstract:
CD13/アミノペプチダーゼNは、炎症を起こした滑膜組織の線維芽細胞様滑膜細胞（FLS）と単球（MN）に発現している。
この研究では、血管新生、単球の遊走、シグナル伝達分子のリン酸化、関節炎の誘導における可溶性CD13(sCD13)の役割を調べた。

◇Key points
可溶性CD13はin vitroおよびin vivoにおいて血管新生促進因子である。
可溶性CD13はマウスに急性炎症性関節炎を誘発し、Gタンパク質共役受容体を介して単球の輸送を誘発する。
可溶性CD13はサイトカイン分泌とシグナル伝達分子のリン酸化を増加させる。

Fig1
A: HDMEC chemotaxis
ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HDMEC)の走化性を様々な濃度の可溶性CD13(sCD13)を用いて調べた。
sCD13は用量依存的にHDMECの走化性を促進した。

B,C: Matrigel HDMEC tube formation assay
sCD13はcontrolと比較し、管腔形成を促進した。

D,E: Matrigel HDMEC tube formation assay シグナル伝達阻害
SP(JnK), PDTC(NFκB), PD(Erk1/2), PT(GPCR)阻害剤は、sCD13による管腔形成を抑制した。SB(P38)阻害は、sCD13による管腔形成を抑制しなかった。

F,G: Matrigel plug angiogenesis assay in vivo
WT C57BL/6マウスにmatrigelを注射し、7日後に回収した。
F: Hb濃度はcontrolと比較し、優位に高かった。
G: Controlは白色であったが、黄色味を帯びた赤色であった。

→sCD13はHDMECの走化性と管腔形成を促進する。
    sCD13はJnk, NFκB, Erk1/2, GPCRはsCD13を介した管腔形成に関与する。
    sCD13はin vivoでMatrigel plug assayにおける血管新生に寄与する。

Fig2
A-C: MN chemotaxis
A: sCD13は濃度依存性に単球(MN)の遊走能を増加させた。
B: シグナル伝達阻害剤のSP(Jnk), PDTC(NFκB), PP2(Src)はsCD13により誘発されるMNの遊走能を抑制した。　シグナル伝達阻害剤のSB(p38)とPD(Erk1/2)はsCD13により誘発されるMNの遊走能を抑制しなかった。
C: シグナル伝達阻害剤のPT(GPCR)はsCD13により誘発されるMNの遊走能を抑制した。

D,E: U937 chemotaxis
D: シグナル伝達阻害剤のSP(Jnk), PDTC(NFκB), PP2(Src), PD(Erk1/2)はsCD13により誘発されるU937の遊走能を抑制した。　シグナル伝達阻害剤のSB(p38)はsCD13により誘発されるU937の遊走能を抑制しなかった。
E: シグナル伝達阻害剤のPT(GPCR)はsCD13により誘発されるU937の遊走能を抑制した。

F: cAMP ELISA
MNにsCD13を追加し、様々な時間で、cyclic AMPの濃度を測定すると、20分後にcAMPが約50%増加した。

→Src, Jnk, NFκB, Erk1/2, GPCRはsCD13を介したMN/U937細胞の遊走に関与する。
    GPCRはCD13によるシグナル伝達経路に重要な枠割を果たす。

Fig3
A,B: MN chemotaxis
A: mutant CD13→CD13酵素不活性
     WT CD13→CD13酵素活性あり 
     mutant CD13とWT CD13はそれぞれMNの遊走能を増加させた。
B:CD13を枯渇させたRA SFにmutant CD13とWT CD13を追加すると、MNの走化性が回復した。
    CD13はCD13の酵素活性とは独立した方法でRAにおけるMNの遊走に関与する。

C: MN western blotting
     CD13(sCD13, WT CD13, mutan CD13)はMNのシグナル伝達分子（Erk1/2, Src）のリン酸化を増加させた。
     CD13は酵素活性と独立してシグナル伝達に効果を示す。D-F: RA FLS western blotting

D: sCD13はRA FLSのErk1/2, Src, NFκBのリン酸化を促進した。
     RA FLSにシグナル伝達阻害剤(PP2, SP, SD, SB)を添加し、sCD13で刺激した。
     Jnk阻害(SP), Erk1/2阻害(PD)はErk1/2とNFκBのリン酸化を抑制した。
     JnkはRA FLSのシグナル伝達を介した上流にある。

E: NFκB阻害剤(PDTC)はsCD13によるNFκBのリン酸化を抑制した。

F: GPCR阻害剤(PT)はRAFLSにおけるErk1/2, Srcのリン酸化を抑制した。

G: siRNA knockdown
     Erk1/2に対するsiRNAをRA FLSにトランスフェクションすると、Erk1/2とNFκBのリン酸化が抑制された。

H: 正常なヒトMN western blotting
sCD13で刺激された正常なヒトMNにおけるErk1/2のリン酸化はSrc(PP2), Jnk(SP), Erk1/2(PD)の阻害によって抑制されたが、NFκB(PDTC), p38(SB)の阻害によっては、抑制されなかった。
同様にNFκBのリン酸化は、Src(PP2), Jnk(SP), Erk1/2(PD)の阻害によって抑制されたが、p38(SB)の阻害によっては抑制されなかった。

→sCD13はその酵素活性とは無関係に、RA SFによって誘導されるMNの遊走とシグナル伝達分子のリン酸化を促進する。
    sCD13はRA FLSとMNのErk1/2, Src, NFκBのリン酸化を誘発する。

Fig4
A-D: RA FLS quantitative PCR and ELISA
         RA FLSをsCD13で刺激するとMCP-1/CCL2とIL-6のmRNAおよびタンパク質の発現が亢進した。
※IL-1βとTNF-αは有意な差はなかった。

→sCD13はRA FLSの炎症性サイトカイン発現を増加させる。

Fig5
A-C: RA ST ELISA
RA患者の滑膜組織を抗CD13抗体であるWM15とID7、Dexamethasoneを加え、サイトカイン分泌を測定した。
WT15はMCP1, IL6, IL8の発現を抑制し、ID7はIL8の発現を抑制した。

Fig6
A-B: マウスにsCD13を注射すると、膝が有意に腫脹した。

C: sCD13注射後の膝HE染色
    滑膜の炎症細胞増加を認めた。

D: sCD13を注射するとMNマーカーであるF4/80染色の著名な増加を認めた。

E-G: RA ST ELISA
          MCP1, IL6, IL1βはsCD13を注射したマウスで優位に高かった。

→sCD13は滑膜組織内のMCP1, IL6, IL1βを増加させ、MNの侵入を増加させることによって、炎症性関節炎に寄与した。

◇Key points
可溶性CD13はin vitroおよびin vivoにおいて血管新生促進因子である。
可溶性CD13はマウスに急性炎症性関節炎を誘発し、Gタンパク質共役受容体を介して単球の輸送を誘発する。
可溶性CD13はサイトカイン分泌とシグナル伝達分子のリン酸化を増加させる。

◇この研究の優れている点
これまでの研究では、CD13の機能を調べるために、CD13に対する阻害剤を用いていたが、この研究では、sCD13と抗CD13抗体を用い、RA FLSとMNの機能解析を行った点。

担当：猪狩　雄蔵