Tumor Necrosis Factor-α Convertase (ADAM17) Mediates Regulated Ectodomain Shedding of the Severe-acute Respiratory Syndrome-Coronavirus (SARS-CoV) Receptor, Angiotensin-converting Enzyme-2 (ACE2)
ADAM-17は、コロナウイルスのスパイクに対する受容体ACE2を細胞表面から切り離す
Daniel W. Lambert, Mike Yarski, Fiona J. Warner, Paul Thornhill, Edward T. Parkin, A. Ian Smith, Nigel M. Hooper and Anthony J. Turner
Proteolysis Research Group, School of Biochemistry and Microbiology, University of Leeds, Leeds LS2 9JT, United Kingdom
J Biol Chem 2005; 280: 30113–30119
＜背景＞
Angiotensin-converting enzyme-2(ACE2)は膜貫通型の蛋白質で、その細胞外ドメインはSARS-CoVのスパイク蛋白の受容体として同定されている。ACE2が可溶性となるとSARS-CoVが細胞に結合できなくなり、感染を抑制できる。今回ACE2を細胞表面から切り離す蛋白質について検討を行った。
＜ポイント＞
・HEK293細胞に人工的にACE2を発現させて実験をする(前半)
・Huh7というACE2がもともと高発現している細胞を使って同じ実験をする(後半)
①いろいろな阻害薬を使用して培養液上清中のACE2が抑制される事を確認する。(細胞表面から切り離されて培養液で検出されるACE2の量が抑制されるのか確認する。)
②細胞にADAMが高発現するように処理して培養液上清中のACE2が高発現していることを確認する。
・HEK293細胞にACE2をtransfection(プラスミドを使用して、核酸を細胞内に導入)する。：HEK-ACE2細胞
Fig1. Shedding of ACE2 involves loss of its cytoplasmic tail
HEK-ACE2細胞を沈降させて、cell lysate(C)と培養液上清(M)を分離する。
PMAで刺激or DEMSOで刺激、ACE2をWBで測定。
PMAで刺激すると培養液上清中のACE2が高発現する。
Fig3. Shedding of ACE2 is inhibited by broad spectrum hydroxamate based metalloprotease inhibitors.
TAPI1:ADAM-17を特異的に阻害するinhibitor
GM600：MMPsを広く阻害するinhibitor
Inhibitorの濃度を分けて処理しPMAで刺激する。
TAPI1,GM6001ともに培養液上清中のACE2を濃度依存性に抑制する。
Fig4. PMA-stimulated ACE2 shedding is sensitive to ADAM17 inhibition.
セクレターゼのinhibitorを使用して培養液上清中のACE2の発現を見る。
GW280264X : ADAM-10+ADAM-17のinhibitor
GI254023X : ADAM-10のinhibitor
ADAM-10のみ抑制してもACE2の発現は抑制されないが、ADAM-10、ADAM-17両方を抑制するとACE2が抑制される。ADAM-17がACE2のsheddingに関与している。
Fig5. Stimulated ACE2 shedding is inhibited by NTIMP3 but not by NTIMP1.
NTIMP1 : ADAM-10のinhibitor
NTIMP3 : ADAM-10+ADAM-17のinhibitor
NTIMP1ではACE2は抑制されないが、TINMP3で処理するとACE2が抑制される。
ADAM-17がsheddingに関与している。
Fig6. Ablation of ADAM17 expression by siRNA reduces stimulated ACE2 shedding
siRNAを用いてADAM-10、ADAM-17を抑制した際のACE2の発現を確認。
ADAM-17を抑制するとACE2も抑制される。
ここまではいろいろなinhibitorを使用して、ADAM-17を抑制すると、培養液上清中のACE2の発現が低下するということの証明を行った。
次に、ADAM17を人工的に高発現させたら、培養液上清中のACE2は高発現するのかということを証明する実験を行った。
Fig7. Overexpression of ADAM17 increases PMA-stimulated ACE2 shedding
HEK-ACE2細胞にADAM-9、ADAM-10、ADAM-17をtransfectionする。
ADAM-17を高発現させるとACE2の発現はどうなるか。
ADAM-17を高発現させるとACE2も高発現する。
ACE2のsheddingにADAM-17が関与する。
Fig7.-Fig10は内因性にACE2が高発現しているHuh7という細胞を用いて同様の実験を行い、ACE2のsheddingにはADAM-17が関与しているという証明をしている。SheddingされたACE2が高発現している場合はSARS-CoVの感染を抑制できる可能性があり、sheddingにADAM-17が関与している。ただし、ウイルスの侵入におけるADAM-17の役割は現在もよくわかっていない。
担当：古屋秀和
