Up-regulation of cytokines and chemokines predates the onset of rheumatoid arthritis.

Kokkonen H¹, Söderström I, Rocklöv J, Hallmans G, Lejon K, Rantapää Dahlqvist S.

Umeå University Hospital, Umeå, Sweden.

Arthritis Rheum. 2010 Feb;62(2):383-91

Abstract

OBJECTIVE: To identify whether cytokines, cytokine-related factors, and chemokines are up-regulated prior to the development of rheumatoid arthritis (RA).

METHODS: A nested case-control study was performed in 86 individuals who had donated blood samples before experiencing any symptoms of disease (pre-patients) and 256 matched control subjects (1:3 ratio). In 69 of the pre-patients, blood samples were also obtained at the time of the diagnosis of RA. The plasma levels of 30 cytokines, related factors, and chemokines were measured using a multiplex system.

RESULTS: The levels of several of the cytokines, cytokine receptors, and chemokines were significantly increased in individuals before disease onset compared with the levels in control subjects; i.e., those representing signs of general immune activation (interleukin-1beta [IL-1beta], IL-2, IL-6, IL-1 receptor antagonist, and tumor necrosis factor), activation of Th1 cells (interferon-gamma, IL-12), Th2 cells (IL-4, eotaxin), Treg cells (IL-10), bone marrow-derived factors (IL-7, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, and granulocyte colony-stimulating factor), as well as chemokines (monocyte chemotactic protein 1 and macrophage inflammatory protein 1alpha). The levels were particularly increased in anti-cyclic citrullinated peptide antibody- and rheumatoid factor-positive individuals, and the concentration of most of these increased further after disease onset. The concentration of IL-17 in individuals before disease onset was significantly higher than that in patients after disease onset. Individuals in whom RA subsequently developed were discriminated from control subjects mainly by the presence of Th1 cells, Th2 cells, and Treg cell-related cytokines, while chemokines, stromal cell-derived cytokines, and angiogenic-related markers separated patients after the development of RA from individuals before the onset of RA.

CONCLUSION: Individuals in whom RA later developed had significantly increased levels of several cytokines, cytokine-related factors, and chemokines representing the adaptive immune system (Th1, Th2, and Treg cell-related factors); after disease onset, the involvement and activation of the immune system was more general and widespread.

Keyword

Nested case-control study: よく調査された集団（closed cohort）を現在から未来に向けて追跡する過程でcasesとcontrolが発生し全てを把握できる場合に行う。追跡は前向き、解析は後ろ向き。

Eotaxin-1/CCL11: CCR3のリガンドで、好酸球、好塩基球、好中球、マクロファージの遊走因子として作用。

 

Medical Biobank of Northern Swedenを用いて、RAを発症する前後で採取された患者血漿中のサイトカイン、ケモカイン濃度を比較し、発症および進行における免疫系の連続的で時間的な関与を評価した。

【Patients and control subjects】

86人（女性65人、男性21人）がRA発症前に血液を採取され、中央値3.3年（1.1-5）で症状が出現していた。コントロールとして各々の患者につき3人の年齢、性別および居住地を一致させて無作為に選択し合計256人（女性194人男性62人）が選択された。対象者は非喫煙、喫煙者、元喫煙者に部類された。69人のRA患者は診断時にも採血されていた。症状出現後の診断までは7.7±3.6ヵ月（mean　± SD）であった。

Table 1.　前患者時、発症時、Cont.の患者背景

【Analyses of cytokines, cytokine receptors, and chemokines】

31のサイトカンおよびケモカインがmultiplex detection kits (Bio-Rad)を用いて測定された。1人の前患者と2人のコントロールは極めて高値で異常値であったため研究から排除した。 

Table 2.　 IL-1β , TNFα, IL-6, IL-2、Th1related cytokine（IL-12, IFN γ ,Th2 related cytokine（IL-4, eotaxin）,Treg related cytokine（IL-10）、IL-7が発症前患者においてコントロールと比較し著明に高かった。

また、MCP-1とMIP-1α、GM-CSFとG-CSFも前患者においてコントロールと比較し著明に増加していた。

 

RA発症に対する感度および特異性を検討

抗CCP抗体およびRFにつづき、eotaxin（感度22.4%、OR:5.8, 95%CI:2.70-12.62）が検出された。この他に検出されたサイトカンの半分はTh1, Th2, Treg関連サイトカンであった。抗CCP抗体とTh1関連サイトカン（IFNγ and/or IL-12）、Th2関連サイトカン（IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 and/or eotaxin）、general activation cytokine（IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-15, IL-1Ra, IL-2R, TNF and/or GM-CSF）との組み合わせは、コントロールのだれもこの組み合わせは持たないため、特異度は100%で感度はそれぞれ14.1%、12.9%、20%であった。

抗CCP抗体とTH2関連サイトカンの組み合わせにおいてより顕著であった（カイ² =14.6, P < 0.0001）

 

Time relationships in pre-patients：時系列分析をしたところ、RA症状の発症に近いサンプルほどIL-2Rα、IL-1β、IL-9、IL-10、eotaxin、GM-CSF、bFGF、IP-10、Mig濃度は有意に増加していることがわかった（他のほとんどのサイトカンも上昇傾向）。濃度の増加は抗CCP抗体陽性と関連していた。

 

Patients versus pre-patients and control subjects (Table 2)　：コントロールと比較するとIL-17, MIF, MIP-1αおよびbFGFを除くサイトカンは関節リウマチ診断時には有意に高値を示し、前患者と比較してもTNF, IL-5, IL-7, IL-13, GM-CSF, G-CSF, bFGF, MIP-1α. MIF, IL-17以外は有意に増加していた。IL-17は有意に低下していた。

 

Stratifications for anti-CCP antibodies and RF in pre-patients：抗CCP抗体陽性の前患者（n=32）で層別化するとコントロールに比較してIL-2Rの増加が追加されたが、他のサイトカインの有意性も保たれていた。RF陽性であった前患者(n=23)で層別化するとIL-2R、TH2関連サイトカン（IL-5, IL-9, IL-13）、IL-17, Migがコントロールと比較し有意に増加していた。RF陰性前患者（n=61）ではコントロールに比較して、大部分のサイトカンの有意性を失われたがIL-13およびIL-8には有意差があった。個別のサイトカンとRFには有意な相関は観察されなかった。

 

Stratifications for anti-CCP antibodies and RF in patients：RA患者においてほとんどのサイトカン、ケモカインはコントロールに比較し有意に増加し、抗CCP抗体陽性例（n=47）でもその優位性は保たれ、抗CCP抗体陰性例（n=22）でもいくつかのサイトカンとほとんどのケモカインでは有意な増加が保たれていた。RF陽性患者（n=57）ではIL-7, IL-8, G-CSF, IP-10, bFGF, MIP-1α , MIP-1 β and MIF 以外はコントロールに比較し有意に増加を認めた。RF陰性患者（n=12）ではIL-6, eotaxin, Mig, IP-10, GM-CSF, PDGF-BB, and TNFの有意な増加を認めた。

 

Random forest analyses（Figure 1）

 

抗CCP抗体につづき前患者をコントロールと区別するために最も重要な因子はeotaxin, IL-13, MCP-1, IP-10,IL-9, MIP-1であった(Figure 1A)。PDGF-BB、MIP-1、Mig、IL-6、IL-17、VEGF、IL-4、およびG-CSFが前患者と患者を区別するための重要なサイトカインおよびケモカインであった(Figure1B)。抗CCP抗体、PDGF-BB、IL-6、MIP-1b、Mig、eotaxin、IL-10、およびG-CSFは、疾患発症後の患者とコントロールを区別する重要な因子であった(data not shown)。

 

ⅰ）重要なポイント

関節リウマチの発症前からすでに免疫系（特に獲得免疫系）に異常が生じており、その異常が進行（血漿中サイトカン濃度が上昇）すると関節リウマチを発症することを示した。特にTh2関連サイトカンと抗CCP抗体がもっとも重要であった

ⅱ）ユニークなポイント

関節リウマチを発症する前後で採取された患者血漿中のサイトカイン、ケモカイン濃度を比較し、発症前の血漿中eotaxin濃度などのサイトカン、ケモカインは健常者群より有意に高値で、発症後はさらに増加することから関節リウマチの発症を予測する因子となることを報告している

ⅲ）今後の研究展開や論文に対する検討課題

発症前後の同じ患者からのサンプル数は少ないため統計学的限界がある

PTPN22遺伝子、HLA SE遺伝子、喫煙習慣を含めた解析も求められる。

ⅳ）自分なりの疑問点

関節リウマチの線維芽細胞様滑膜細胞の攻撃的で侵襲的な表現系の形勢にeotaxinの活性化が影響するかを検討していく。

 

担当：若林邦伸